Cómo funcionan y para qué sirven en el diagnóstico del coronavirus: sensibilidad, especificidad, falsos positivos, falsos negativos
Lo dijo la OMS ya hace unos meses atrás
Durante una infección, el virus se multiplica activamente. Cuando comienza, el virus se puede detectar en muestras biológicas (frotis faríngeo o nasofaríngeo, aspirado traqueal). Primero hay un período de latencia en el que todavía no es posible detectar la respuesta de su sistema inmune. Pero después de unos días, comienza a producir anticuerpos. Se producen primero anticuerpos del tipo IgM hasta alcanzar un máximo a los 7-10 días para, más tarde, casi desaparecer. Esta respuesta primaria es indicativa de una infección aguda. Posteriormente se producirá la respuesta inmune secundaria, más rápida, intensa y prolongada. Se producirán anticuerpos de tipo IgG y durarán más tiempo en la sangre, entonces hablamos del primer tipo de prueba, Prueba Rápida para covid IgM /IgG
Para detectar la presencia del virus (detección directa) podemos emplear dos tipos de test: la PCR que detecta el genoma del virus o los test inmunológicos que detectan las proteínas (antígenos) del virus, método en tiempo real técnica aspirado nasofaríngeo. El tercer tipo de prueba es el que detecta los anticuerpos que produces como respuesta a la infección, son las pruebas serológicas de detección indirecta del virus (prueba de detección de Antígeno. Aunque hay varias modalidades de cada uno de estos tipos de pruebas, vamos a explicar brevemente cómo funcionan.
Detectar el genoma del virus: la RT-PCR
El genoma del coronavirus SARSCov2 es una molécula de ARN mono cadena de unos 30 kilo bases. Una vez tomada la muestra (el frotis nasofaríngeo o aspirado más profundo), lo primero que hay que hacer es extraer el genoma del virus. Esto normalmente se hace mediante un kit de extracción de ácidos nucleicos. Así, además de inactivar el virus, obtenemos su genoma ARN. A continuación, hay que copiar ese ARN en forma de ADN. Eso se hace con otro kit que emplea una enzima que se denomina transcriptasa inversa o Retro Transcriptasa (de ahí el “RT”, del nombre RT-PCR). Luego, el genoma del virus en forma de ADN se amplifica mediante la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR, en inglés. Ojo, aquí PCR no significa “proteína C reactiva”). Esta amplificación consiste en hacer millones de copias de un fragmento del ADN, de forma que podamos “visualizarlo” o detectarlo mediante un sistema concreto. El sistema de PCR a tiempo real permite incluso cuantificar la muestra, es decir, saber cuántas copias del virus tenemos por mL.
Si la reacción es positiva, demuestra que había ARN del virus, es decir que la persona estaba infectada.
Como lo primero que obtuvimos del virus fue su genoma, este tipo de pruebas son las primeras que se desarrollaron. De hecho desde el 13 de enero, la OMS publicó el primer protocolo. Normalmente, se suelen realizar dos ensayos: uno de screening y un segundo confirmatorio. Incluso se puede hacer un tercero adicional de confirmación. Estos tres ensayos de RT-PCR se diseñan para detectar tres genes distintos del virus.
Estos test de PCR son muy específicos y sensibles. Suelen tardar en realizarse unas cuantas horas. Requieren un equipamiento y un personal técnico especializado. Pueden dar resultado positivo en personas antes de que manifiesten síntomas, pero que ya tengan el virus. A lo largo de la enfermedad pueden permitir hacer un seguimiento de cómo va la infección, porque cuando la persona ya se ha curado y no tiene el virus activo, en principio debería dar negativo. No se puede descartar que pacientes convalecientes “sin síntomas” puedan dar positivo en la RT-PCR y seguir siendo portadores del virus.
Detectar las proteínas del virus: Prueba de detección antígenos
Otra manera de confirmar la presencia del virus es detectar sus proteínas o antígenos. Hay distintas técnicas o soportes sobre los que hacer este tipo de Prueba, pero en definitiva más o menos todos tienen el mismo fundamento. Sobre un soporte se fijan anticuerpos específicos que reaccionarán contra alguna proteína del virus. En este caso es contra las proteínas de la superficie de la envoltura (proteína S), las que se proyectan hacia el exterior y forman esas espículas que dan el nombre a este tipo de virus, corona-virus. Si en la muestra (las mismas que para la RT-PCR) hay partículas virales, éstas quedarán fijadas al anticuerpo. Es como si el virus hubiera sido capturado por el anticuerpo. A continuación, se añade un segundo anticuerpo contra el virus de manera que se forme un emparedado o “sándwich”: anticuerpo-virus-anticuerpo. Este segundo anticuerpo estará marcado o señalado de alguna manera para poner de manifiesto la reacción.
Si la reacción es positiva, demuestra que había proteínas del virus, es decir que la persona estaba infectada.
Este tipo de prueba basado en la detección de moléculas es muy habitual en diagnóstico clínico. Su es el mismo que las tradicionales pruebas de detección de drogas o las pruebas de embarazo. En el caso que nos ocupa, tardó en aparecer en escena porque se requiere el empleo de anticuerpos de captura específicos frente a este virus concreto. La ventaja es que son mucho más rápidos, y según el tipo de soporte, se pueden realizar en unos pocos minutos. No necesitan un equipamiento especifico ni un personal técnico altamente cualificado. La desventaja es que son mucho menos específicos y sensibles que la RT-PCR.
A los dos tipos de prueba de detección directa del genoma o de las proteínas del virus: que la reacción sea positiva no implica que el virus esté activo y sea infectivo. Es decir, podemos detectar su genoma o sus proteínas pero que el virus no esté completo, es decir, podemos estar detectando “restos” del virus.
Detectar anticuerpos frente al virus: Prueba serológica
La tercera aproximación consiste en detectar la respuesta inmune frente al virus, los anticuerpos. Es una detección indirecta, no detectamos el virus, sino que ponemos de manifiesto la respuesta inmune frente a él. En este caso la muestra que vamos a emplear es una gota de sangre, porque vamos a detectar los anticuerpos que ha generado contra el virus.
Hay distintas técnicas o soportes sobre los que hacer este tipo de prueba, pero más o menos todos tienen el mismo fundamento. En este caso, sobre el soporte se fijan proteínas del virus, normalmente las proteínas más expuestas hacia el exterior, como la proteína S de la envoltura. Esto es así porque nuestro sistema inmune lo primero que reconoce es lo que está más hacia el exterior del virus. Como con esta prueba queremos detectar los anticuerpos que producimos, la muestra será una simple gota de sangre. Si en la muestra hay anticuerpos contra el virus, se pegarán y quedarán fijados a las proteínas del virus. Luego, se añade un segundo anticuerpo contra el anticuerpo humano: estos suelen ser anticuerpos de otro animal que reaccionan contra nuestros propios anticuerpos, porque los anticuerpos humanos en realidad actúan como antígenos en otros animales. Se forma así un trío: proteínas del virus-anticuerpo humano-anticuerpo de otro animal. Este segundo anticuerpo estará marcado o señalado de alguna manera para poner de manifiesto la reacción.
Si la reacción es positiva, demuestra que había anticuerpos contra el virus, es decir, que la persona en algún momento ha estado en contacto con el virus y su sistema inmune ha reaccionado produciendo anticuerpos. Esto no quiere decir que necesariamente esté infectado, quizá se ha curado, o simplemente ha estado en contacto con el virus y no ha tenido síntomas.
Este tipo de test también se ha desarrollado después que los de RT-PCR, cuando ya hemos tenido suero de pacientes que han pasado la enfermedad. También, tienen la ventaja de que son mucho más rápidos que la PCR, y según el tipo de soporte, se pueden realizar en menos de pocos minutos. No necesitan un equipamiento especifico ni un personal técnico altamente cualificado. La desventaja es que son mucho menos específicos que la RT-PCR. Otra importante desventaja de este tipo de prueba es que nuestro organismo necesita varios días para producir anticuerpos detectables. O sea, que una persona puede estar infectada, pero durante los primeros días no dar positivo en este tipo de prueba.
Algunas pruebas de anticuerpos pueden distinguir el tipo de inmunoglobulina: si es IgM, indicativo de una infección reciente, o IgG, indicativo de una respuesta secundaria, y, por tanto, más prolongada.
Que podemos conocer sobre Sensibilidad y especificidad de las pruebas
Cuando queremos estudiar el rendimiento o lo efectivo que es una prueba de diagnóstico lo que hacemos es comparar el resultado de esa prueba en un grupo control de individuos que sabemos a ciencia cierta que están sanos o están infectados. Esto normalmente se hace comparando nuestra prueba con otro que se considera el patrón de referencia (gold standard). Con estos resultados se construye la tabla que nos muestra la distribución de sanos y enfermos y el resultado de la prueba.
Así, podemos clasificar los pacientes como verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos (no están infectados pero el test es positivo) y falsos negativos (están infectados pero el test es negativo). Con estos datos podremos calcular la sensibilidad y la especificidad de nuestro test.
La sensibilidad de la prueba representa la probabilidad de clasificar correctamente a los infectados o, lo que es lo mismo, a los verdaderos positivos. Una sensibilidad alta significa pocos falsos negativos. Es una proporción en la que en el denominador se sitúa el total de infectados y en el numerador los positivos verdaderos:
Sensibilidad = verdaderos positivos / total de infectados
Por su parte, la especificidad de una prueba representa la probabilidad de clasificar correctamente a los sanos o, lo que es lo mismo, a los verdaderos negativos. Una especificidad alta significa pocos falsos positivos. Es una proporción en la que en el denominador figuran el total de sanos y en el numerador los negativos verdaderos:
Especificidad = verdaderos negativos / total de sanos
Para entenderlo mejor, vamos a poner un ejemplo. Supongamos que tenemos una población de 100 individuos y queremos valorar la utilidad de la RT-PCR para el diagnóstico de la enfermedad por el coronavirus. En este caso seleccionamos el historial clínico (analítica, radiografías, etc.) como el patrón de referencia (asumiendo que esos datos no fallan nunca a la hora de clasificar sanos y enfermos y diagnosticar la COVID-19) y realizamos la RT-PCR a los 100 individuos. Los datos clínicos nos indican que 30 de los 100 tienen la enfermedad de COVID-19: hay 70 sanos y 30 enfermos.
Al realizar la RT-PCR a las 100 individuas podríamos obtener los siguientes resultados (insisto que es un ejemplo ficticio):
Según esto, la sensibilidad de nuestro test de RT-PCR es del 93% (28/30) y la especificidad del 96% (67/70).
Uno de los problemas de estos parámetros es que la sensibilidad nos dice la probabilidad de clasificar correctamente al enfermo una vez que sabemos que está enfermo. Por su parte, la especificidad nos dice la probabilidad de clasificar correctamente al sano pero una vez que ya conocemos que está sano. Pero esto en la práctica, muchas veces, lo desconocemos. Cuando un test diagnóstico tiene tanto la sensibilidad como la especificidad cercana al 100% se comporta como un test de referencia y por lo tanto sus resultados serán casi siempre válidos. Sin embargo, esta circunstancia es excepcional, muy pocas veces un test es 100% sensible y específico. La sensibilidad de la RT-PCR suele ser alta, alrededor de un 95%, y la de los test serológicos de un 70%. Por eso, se suelen emplear varias pruebas diagnósticas al mismo tiempo, porque nos darán más información de la situación real.
Una pregunta que nos hacemos comúnmente ¿por qué a veces las pruebas dan resultados falsos? Las causas son múltiples. Los falsos negativos pueden ser debidos: en el caso de la RT-PCR, a que la cantidad de virus o de muestra sea escasa, la liberación de los mismos sea intermitente, no se haya tomado bien la muestra, que no se haya extraído correctamente el genoma del virus, fallo en los reactivos o inhibición de la reacción; en el caso de los test serológicos, que la muestra se haya obtenido durante el periodo ventana en el que todavía no se hayan producido los anticuerpos, fallos en los reactivos del test, o baja sensibilidad.
Los falsos positivos pueden ser debidos: en el caso de la RT-PCR, a contaminación en el procesamiento de las muestras o reacción cruzada con otros virus, incluso fallo en el etiquetado; en el caso de los test serológicos, reacción a otros virus.
¿Qué resultado nos puede dar la combinación de la RT-PCR y la detección de anticuerpos?
La prueba de RT-PCR nos indica la presencia del virus, quién está infectado en ese momento. Las pruebas de detección de anticuerpos nos indican quién estuvo infectado y quizá está inmunizado, al menos durante un tiempo, contra el coronavirus. Según esto, y con todas las reservas según la sensibilidad y especificidad de cada test, si combinamos resultados de RT-PCR, con detección de anticuerpos (IgM e IgG) se podría plantear lo siguiente:
Sin embargo, este planteamiento es una simplificación y tiene sus limitaciones. El que no detecte anticuerpos puede no significar que no estés inmunizado. En el caso de infecciones por virus, que son intracelulares, la inmunidad celular no mediada por anticuerpos es tan importante o más que la mediada por anticuerpos. Es decir, en ocasiones, no hay anticuerpos pero el individuo puede estar “inmunizado”.
¿cómo se sabe que los genes que se detectan son específicos del virus covid 19?
Primero, antes de hacer el RT-PCR, las muestras se tiene que tratar con un kit para degradar el ADN que pueda haber y que sólo quede ARN.
En segundo lugar, se conoce la secuenciaciación genómica del virus, entonces se pueden diseñar unas pequeñas bases de genoma (llamados 'Primers' en inglés) que se utilizan para detectar el genoma del virus presente en la muestra. Éstos hibridarán y serán la base para transformar ese ARN del virus a ADN (que es la base de esta prueba RT-PCR). Así se asegura que de todo lo presente en la muestra, sólo detectas y amplificas lo que quieres buscar
¿Pueden las mujeres embarazadas o en periodo de lactancia hacerse las pruebas?
Sí, no hay ningún daño para la madre o el bebé cuando se realiza las pruebas.
¿Pueden los menores de edad hacerse la prueba?
A menores de edad se recomienda realizar sólo la prueba de PCR.
Dra. Olga García, Maestría en seguridad y salud en el trabajo, Universidad Rey Juan Carlos ( Madrid España)
BIBLIOGRAFIA
https://www.minsalud.gov.co/Paginas/Minsalud-actualiza-lineamientos-de-realizacion-de-pruebas.aspx
https://www.minsalud.gov.co/Ministerio/Institucional/Procesos%20y%20procedimientos/GIPS21.pdf
https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica
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